摘要

CTC富集技术是CTC研究的基础，也是CTC研究的重点和难点。本文就CTC EpCAM阳性富集技术与阴性富集技术的进行重点比较，以基于细胞系spike-in样本和临床样本的头对头比较，显示顿慧医疗采取的EpCAM阴性富集技术展现出更佳的灵敏度和检出率，在CTC富集和检测中具有更显著的优势。

CTC作为液体活检的重要标志物，在临床中具有广泛的应用价值。然而，CTC的临床应用依然面临不小的挑战，具体包括细胞浓度低、细胞易降解、细胞难鉴别等。CTC的形态与白细胞类型，仅从形态角度加以区别显然有失偏颇，然后CTC又具有高度的异质性，常常发生表皮间充质化（EMT）等^[1]，这给CTC的富集和鉴定提出了不小的难题。

01. CTC富集和鉴定的方法学

CTC的富集主要基于其物理学和生物学特性进行，包括物理特性分离法、免疫亲和富集法以及基于细胞的物理和生化性质的联合分离法等^[2]。在过去的几年里，微流控技术作为基于物理学特性富集的方法被广泛使用^[3,4]，而近几年基于标记富集的CTC富集技术则更为主流。目前FDA唯一获批的CTC检测平台是CellSearch，CellSearch是一类依据细胞表面蛋白EpCAM的抗体进行富集的方法^[5]。

然而，有不少研究表明，CTC细胞具有EMT特性，EpCAM表达大大降低。例如，图1A针对4个前列腺癌细胞系的EpCAM和EMT marker Vimentin的流式结果显示，PC-3和PC-3M的Vimentin高表达，EpCAM的表达则大大下降^[6]；图1B针对胃癌患者的CTC进行EpCAM和EMT marker Vimentin的多色免疫荧光显示存在EpCAM-的间充质型CTC^[7]；图1C针对乳腺癌患者的CTC的多色免疫荧光同样支持存在EpCAM-的间充质型CTC^[8]；图1D针对卵巢癌患者腹水的CTC的单细胞测序结果进行分析显示，存在EpCAM+和EpCAM-两类CTC^[9,10]；图1E针对胰腺癌肝转移患者的原发灶、转移灶和外周血富集的CTC进行单细胞测序结果显示，CTC较原发灶和转移灶的肿瘤细胞相比，EpCAM的表达大大下降^[11]。EpCAM在泛癌种的CTC中的表达水平的多样性显示仅局限于EpCAM的阳性富集可能会造成大量的假阴性，对于CTC富集的技术，可能需要持有更多元更谨慎的态度。

图1. CTC的EpCAM表达多样性

02. 顿慧医疗的EpCAM阴性富集策略

为解决EpCAM异质性对CTC富集的不良影响，顿慧医疗与复旦大学（附属中山医院）肝癌研究所樊嘉院士、杨欣荣教授合作开发的全自动的基于EpCAM阴性富集平台，包含阴性富集、免疫荧光标记和基于机器学习的CTC识别等步骤，富集的CTC可用于单细胞转录组测序、基因组测序、蛋白组学分析等多组学研究，大大扩展了CTC的临床和科研应用，相关研究发表于Molecular Oncology杂志^[12]。

顿慧医疗所采用的EpCAM阴性富集和识别策略的优势在于：

1. 克服了EpCAM表达异质性引起的假阴性，大大提高了检出率。

2. 基于高维度信息抓取的图像识别获取细胞信息，更大限度地富集CTC，降低了假阴性，大大提高了检出率。

3. 基于人工智能的机器学习识别细胞，更大限度地准确识别CTC，降低了假阳性和假阴性，提高了CTC识别的准确性。

为进一步验证上述优势，该研究将4种EpCAM表达各异的细胞系以不同浓度加入到外周血样本中（图2A），与CellSearch平台进行头对头比较，其中EpCAM中、低表达的HepG2，SkBr3和T24细胞系显著高于CellSearch平台的回收率（图2B），凸显了顿慧医疗的阴性富集策略在EpCAM中、低表达样本中的检出优势。针对异质性更高的临床样本，顿慧医疗的阴性富集策略呈现更高的检出率（图2C）。

图2. EpCAM阴性富集策略和EpCAM阳性富集策略性能比较

小结

鉴于CTC的高度异质性，联合阴性富集和表面抗原marker的鉴定有利于更大程度地降低细胞损失和降低检测假阴性。顿慧医疗的阴性富集策略针对EpCAM中、低表达水平的CTC具有更显著的检测性能，因此阴性富集技术在CTC富集中具有更显著的优势。

参考文献： 

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